原來刺客教條系列採雙軌劇情，玩家所扮演的戴斯蒙，為了在現代找出刺客家族守護長達千年的秘密，將藉由虛擬實境科技回溯基因記憶，回到中世紀扮演自己的祖先，包括阿泰爾、伊吉歐等人，以他們的視角親身體驗歷史。讓人不禁聯想到《駭客任務》這段經典對白：「何謂真實？你如何定義真實？如果你的真實來自所聞、所嚐、所見……等一切感覺，那麼真實不過是被腦部編譯過的電子信號。」

因此玩家透過戴斯蒙之眼，得以重回中世紀與文藝復興時代，代表「潛行黑暗卻為光明服務」的刺客家族，和妄圖操控人類思想的聖殿騎士團展開爭奪伊甸園「禁果」的戰爭，並參與中世紀眾多真實歷史事件和政爭陰謀，在歷史的闇影中默默守護人類的自由意志。

《刺客教條：兄弟會》的劇情承接《刺客教條 2》，是伊吉歐三部曲的中章。雖然 2 代時伊吉歐一度以個人之力壓制波吉亞家族及其以教宗之名統領的聖殿騎士團，但本作中教宗之子則是憑強大軍力率騎士團捲土重來，不但打敗伊吉歐也奪走禁果。

於是羅馬城落入波吉亞家族的掌控，在獨裁者的高壓統治下百業蕭條、民不聊生，但波吉亞家族卻進一步籌畫戰爭，準備將義大利全土納入麾下。為了奪回禁果與阻止戰爭，伊吉歐成立地下組織刺客兄弟會，除了號召馬基維利、達文西、伯爵夫人卡特琳娜等人加入，也串連工商業界並積極招募平民，在累積反抗實力的同時也復興羅馬，因此延伸出眾多嶄新遊戲要素：
 
◆ 招募參與戰鬥的刺客新血

在高壓統治下雖然大部分人民迫於威脅保持沈默，但仍有不少人願意加入兄弟會投身反抗運動前線。前提是玩家要找到這些人，並協助他們脫離困境。和前作傭兵、盜賊等雇傭關係不同，兄弟會成員能夠始終伴隨玩家，只要玩家一個手勢，他們就能群起攻之協助刺殺，甚至也能在玩家指派下獨立進行任務，在過程中獲取經驗值而成長。
 
◆ 投資工商 復興羅馬

面對波吉亞家族的暴虐，羅馬城不僅百業蕭條甚至連百年古蹟也崩毀。因此玩家可以投資商店開業尋回城市人氣，這些資產也能為伊吉歐的銀行帳戶帶來獲利，店面增加也會讓玩家的藥品、武器、裝備……補給更為便利，另外也能重建花費較高卻能大幅改變市容的古蹟與文化建築。
 
◆ 全新動作招式

右手寒刃割喉，左手袖砲爆頭。在兄弟會中Ezio擁有許多過去未見的戰鬥技巧，能左手槍、右手劍，同時搭配不同武器施展連擊，比以往更有殺傷力；同時新增投技，把敵人一把摔飛的身手讓人聯想到合氣道或柔術；反擊招式、武器型態也大量更新，像是擲斧殺人等。
 
◆ 殺戮兵器登場

出於某種原因，除了降落傘、武裝滑翔翼等，達文西又製作了許多原本不該出現在世上的殺戮兵器原型，包括機槍、坦克、艦砲等。玩家將有機會操縱這些兵器和聖殿大軍正面衝突，體驗與遊戲主線大異其趣的玩法。另外馬匹的功能也獲得擴增，Ezio 將會擁有馬上的攻防與暗殺技巧，而敵人也出現強力的騎兵單位，與馬兒打交道的時間大幅增加。
 
◆ E3 展最佳多人遊戲

在多人模式中共有醫生、理髮師、交際花、牧師……近 20 種大量職業能夠選擇，不同職業能使用不同武器和招式。不管何種職業，都能在對戰過程獲得經驗值，升級後可解開新技能與裝備，像是煙霧彈之類的實用道具。而當玩家選定職業後，會發現對戰地圖裡有許多和自己或其他玩家造型一樣的 NPC，因此如何利用人群隱藏自己，找出動作與周遭格格不入的角色，是對戰裡生存和獲取高分的關鍵。